摘要：Apidaecin型抗菌肽指由昆虫细胞诱导表达的一类小的、富含脯氨酸 (Pro) 的、长度为18-20个氨基酸的抗菌肽，是目前已知的最大的抗菌肽家族。结构分析表明，apidaecin含有两个活性区域，即决定抗菌肽抗菌活性的保守区和决定抗菌肽抗菌谱的可变区。Apidaecin为由基因编码的没有经过翻译后修饰的抗菌肽，其主要对一些革兰氏阴性菌具有抑菌活性。Apidaecin发挥抑菌活性的机制包括以下几步：首先apidaecin非特异性地结合于细菌细胞外膜的脂多糖 (LPS) ，随后进入细胞内外膜之间的外周胞质，并通过一种特异性的方式不可逆地与细胞内膜的受体/停靠蛋白（可能是定位于细胞内膜上的一种酶型转运系统）结合；最终，抗菌肽进入细胞内部并与其最终的靶蛋白相互作用。Apidaecin独特的作用机制使其成为有潜力的传统抗生素的替代品。本文综述了apidaecin类抗菌肽的多样性、结构与功能的关系及其作用机制的研究进展。

关键词：apidaecin，多样性，结构与功能的关系，作用机制

昆虫免疫与高等动物的免疫相比，有其独特的免疫系统和免疫机制。昆虫无T和B淋巴细胞，无免疫球蛋白及完整的补体系统，缺乏特异的抗原抗体反应，一般认为昆虫为“非专一性”免疫。所谓“非专一性”，一是指诱导源与诱导产物无相应的特异性结合，不同的诱导源如生物的、物理的、化学的因子，均可诱导昆虫产生类似的抗菌物质；二是指诱导产生的抗菌物质具有广谱性，而并非针对某一特定的抗原（诱导）物质，称之为获得性免疫 (Casteels et al., 1994)。这些抗菌物质主要为一些抗菌肽，他们作为体液防御的一部分共同构成一个广谱抗菌体系，在许多方面都可与脊椎动物免疫防御系统相媲美。目前已从多种受到免疫学攻击的昆虫体内分离出不同的抗菌肽，主要有蛾类/蝶类 (鳞翅目)、蝇类 (双翅目)、蜜蜂类/胡蜂类 (膜翅目) 和甲虫类 (鞘翅目)。这些抗菌肽中的一些种类如溶菌酶 (lysozyme) 、防卫素 (defensin) 和天蚕素 (cecropin) 广泛存在于多个目昆虫体内，甚至在哺乳动物组织中也有发现 (Lehrer et al., 1991)，而其他的抗菌肽则几乎严格局限于某一类昆虫体内存在，如蜜蜂抗菌肽apidaecin、abaecin 和hymenoptaecin (Casteels et al., 1989; Rees et al., 1997)，其中以apidaecin 型抗菌肽研究得最多。

1.          Apidaecin的诱导产生

Apidaecin最早是从感染后的“免疫”蜜蜂血淋巴中分离出来的，被定名为蜜蜂肽apidaecin (Casteels et al., 1989; Craig et al., 1989)。Apidaecin是膜翅目昆虫经感染诱导而产生的，没诱导的对照组蜜蜂的apidaecin mRNA 数量少，apidaecin 转录水平随着诱导而增加，诱导3h 后其转录稳定而显著增加，12h 后apidaecin 转录增加较小。然而，在蜜蜂胸部诱导后apidaecins 转录值可达到感染前可检测水平的600 倍。诱导产生的mRNA 水平与感染蜜蜂血淋巴中apidaecin 成熟肽的增长数量很一致。感染后12h 检测到诱导明显产生了apidaecin，可达到对照组的4 倍，36h增加到10倍以上。蜜蜂淋巴中apidaecin 最高浓度可达360 μg/mL (Casteels et al., 1993)。

2.          Apidaecin的生物多样性

Apidaecins是最早从受E.coli诱导的蜜蜂（Apis mellifera）淋巴液中发现的一类新型抗菌肽（Casteels等，1989），包括3个精氨酸和6个脯氨酸残基，对革兰氏阴性菌有特异的抗菌功能，属于可诱导表达的抗菌肽。最初发现的此类抗菌肽有3种，即HbIa, HbIb和HbII，目前从7 种昆虫体内已经分离到了共13个同种型（isoform）的apidaecins 型抗菌肽（Casteels1等，1994），包括来自于大黄蜂 (Bombus terrestris) 的Bb+A和Bb-A型、来自于杀蝉泥蜂 (Sphecius speciosus) 的Ck P和Ck A、来自于虎头蜂 (Dolichovespula maculata) 的Ho+、来源于小黄蜂 (Vespula maculitrons) 和德国黄蜂 (Paravespula germanica) 的Yj+S and Yj-S，和来自于寄生峰 (Coccygomimus disparis) 的Cd1+, Cd1-, Cd2-, Cd3+和Cd3-. 所有的产生apidaecin的蜂类都属于膜翅目昆虫的细腰亚目。这些apidaecin类抗菌肽的长度分别为16-21个氨基酸，其生物合成简单且不需要翻译后修饰。根据克隆到的cDNA的序列分析，可能含有另外一个apidaecin HbIII，即HbIb肽的第九个氨基酸为Ser，但是，到目前还没有检测到HbIII异构体的存在。来源于不同昆虫的apidaecin的异构体如表1中所示，保守区域以黑体标出。

对蜜蜂cDNA序列的分析表明，apidaecin的不同异构体都以多种重复偶联于同一条前体分子上，具有抗菌活性的apidaecin前后分别都含有两段要加工去掉的序列，即“EAEPEAEP”和“RR”。经过加工后的单个的前体蛋白可以产生12个apidaecin的异构体。具有活性的apidaecin只能在成年蜜蜂中检测到，而幼蜂中只含有大量的没有活性的前体分子 (Casteels-Josson et al 1993)。以来自蜜蜂淋巴的apidaecin为例，HbIa、HbIb和HbII具有非常类似的抗菌活性，而他们在免疫的蜜蜂淋巴中的含量却差异很大，其中HbIa大约含有5%，HbIb大约含有80-90%，HbII含量大约为5-15%，而这3种肽总的含量大约为多于50 nmol/ml (或10μg/ml)。

不同型的apidaecin具有很高的同源性（Casteels et al., 1994）从表1可以看出，apidaecin型抗菌肽的部分序列在进化上高度保守，即C末端的PRPPHPRL序列、R/K-P二肽序列 (位于HbIb序列的第4-5个氨基酸) 和第九位上的Pro (HbIII除外)。不同apidaecin异构体的插入序列和N-末端区域是可变的，但变化很小 (单个或两个氨基酸替换)，而且由于不同的apidaecin的异构体来源于同一的前体分钟，所以肽的来源越接近，则其同源性越高。

3.          Apidaecin的异源融合表达

Apidaecin已经在不同的宿主，包括链霉菌、大肠杆菌和乳酸乳球菌中表达。Taguchi等 (1992) 将apidaecin异构体HbIb (AP1) 的编码基因通过连接子连接于链霉菌枯草杆菌蛋白酶抑制剂 (Streptomyces subtilisin inhibitor, SSI，一个二聚体蛋白，能够强烈的抑制枯草杆菌蛋白酶)，其中的连接子长度为12 bp，编码的氨基酸序列能够被血凝结因子Xa特异切割。将该融合基因在浅青紫链霉菌菌株66中成功的分泌表达，而且表达的融合蛋白SSI-AP1具有双功能活性，即SSI蛋白的枯草杆菌蛋白酶抑制活性和apidaecin的抗菌活性。纯化的融合蛋白经过血凝结因子Xa特异切割后的apidaecin也具有明显的抑制活性 (Taguchi et al., 1994)。SSI-AP融合蛋白在大肠杆菌中的表达也被研究，该研究组采取了一种巧妙的方法对apidaecin在E. coli中的表达水平进行检测，即根据表达的apidaecin肽对大肠杆菌的抑菌活性，则若肽的表达量越高，则表达宿主的生长受抑水平越高，这样通过检测宿主细胞的生长水平就可方便的推测apidaecin肽的表达量。同样地，将突变的apidaecin基因导入该表达系统，则还可以用来对apidaecin的结构与功能的关系进行间接地分析 (Taguchi et al., 1992, 1994)。

孙超等 (2001) 将apidaecin的基因与泛素基因序列进行融合，并在乳酸乳球菌nisin诱导表达系统中进行表达。表达的融合蛋白本身没有抗菌活性，只有经泛素特异蛋白酶UBP1切割去掉N-端的泛素序列后，重组的apidaecin才显示出明显的抑菌活性。这表明，泛素的存在抑制了apidaecin的抑菌活性。

4.          Apidaecin结构与功能的关系

4.1.       保守区域和抗菌活性

从表1.4中可以看出，apidaecin含有两个区域，与抗菌肽的一般抗菌活性相关的保守区和与抗菌肽的抗菌谱特征相关的可变区。研究表明，apidaecin保守区的微小变化会降低其抗菌活性，甚至使其活性完全丧失，如AP HbIb的突变体P9L的活性将为其野生型的1/3 (Taguchi et al., 1994; 1996)，以在C末端发生突变的突变体P14L、P14T、L18P、P16T和L18Q的抗菌活性最低 (Taguchi et al., 1996)。

Casteels 等 (1994) 发现，HbIII 的P9S突变体几乎对所有的测试菌都没有抑菌活性。Castle 等 (1999) 构建了一系列的Ho+的突变体，并对他们的抗菌活性进行 了检测，结果如表1.5所示。从表中可以看出， P10A突变体对E. coli, 克雷伯氏菌属 (Klebsiella) 和志贺氏菌属 (Shigella) 菌株的抑菌活性明显的低于P13A，但对农杆菌的活性却高于P13A. H14A, H14Q, H14R 突变体只有微弱的抑制不同肠杆菌科 (Enterobacteriaceae) 菌株的活性。突变体H14A丧失对农杆菌的所有活性，R16A的抑菌活性比R11A 低两个数量级而比野生型apidaecin的活性低3个数量级。C末端缺失的apidaecin完全丧失了对所有测试菌株的抑菌活性。突变体L17G的抑菌活性也大分丧失，而L17A引起的活性丧失减弱的程度要弱，这表明较小的CH₃基团（Ala和Gly）能够在一定程度上提高抗菌活性。 L17S 的活性并没有显著变化，这否定了以前的一个疏水尾巴对抗菌活性至观重要的说法。C末端的L-Leu由D-Leu (‘‘L17L’’) 替代极大降低了apidaecin对除了农杆菌外的测试菌株的抑菌活性 (下降了接近10倍)。

这表明，Apidaecin序列第九位 (HbIb) 的Pro和C-末端对其抗菌肽活性发挥着非常重要的重要，在这些进化上高度保守的氨基酸残基的突变会极大的降低抗菌肽的抑菌活性。

4.2.       可变区域和抗菌谱

对apidaeicn的可变区域的突变很好的保留了抗菌肽的抗菌活性，但其不同细菌菌株的活性大小发生了变化。Casteels等 (1994) 研究了18个apidaecin型抗菌肽对32个测试菌株的抑菌活性，以用来研究可变区的变化对肽抗菌活性的影响，结果见表1.6。这些肽中除了HbIII外都具有相同的保守区域，所以他们的区别都在可变区。研究表明，除了HbIII异构体外，其他的apidaecin具有明显的抑菌活性，但抗菌谱和对不同菌株的特定活性存在差异。举例来说，用Lys替代异构体Cd1+中的一个Arg和一个Gln (即异构体Cd3-)，则Cd3-对小肠结肠炎耶尔森氏菌 (Yersinia enterocolitica) 的活性丧失，而却新产生了对空肠弯曲杆菌 (Campylobacter jejuni) 的杀菌活性 (表1.6)。